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        Foi realizada no último dia 9 a defesa da tese intitulada “Inibição da função redox de APE1/REF-1 e sua influência no mecanismo de reparo de DNA e regulação transcricional em um modelo de estimulação inflamatória”, apresentada pela doutoranda Fabrícia Lima Fontes como parte dos requisitos para obtenção do título de doutora em Ciências da Saúde (CCS-UFRN). Fizeram para da banca os doutores Andre Ducati Luchessi (DAC-UFRN), Riva de Paula Oliveira (DBG-UFRN), Carlos Renato Machado (UFMG), Jenifer Saffi (UFCSPA) e Lucymara Fassarella Agnez Lima (DBG-UFRN, orientadora). Parabéns e sucesso Fabricia!!!

 

     Hoje dia 12 de dezembro, ocorreu a defesa da tese intitulada “Identificação e caracterização molecular de mutações germinativas em indivíduos com síndrome de câncer de mama e ovário hereditário”, apresentada pela doutoranda Ana Rafaela de Souza Timoteo, pelo programa de Bioquímica da UFRN. Fizeram parte da banca os doutores Daniella Regina Arantes Martins Salha (DBG-UFRN), Viviane Souza do Amaral (DBG-UFRN), Danielle Queiroz Calcagno (UFPA), Edilmar De Moura Santos (LNRCC) e Tirzah Braz Petta Lajus (DBG-UFRN, orientadora). Parabéns e sucesso a Ana Rafaela também!!!

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Nos dias 9 e 12 de dezembro teremos mais duas defesas de tese do LBMG, confira abaixo os trabalhos que serão defendidos. Estão todos convidados!!!

Discente: Fabrícia Lima Fontes

Orientadora: Dra. Lucymara F. Agnez Lima

Data: 09/12/2016
Hora: 14:00
Local: sala SS1 do Departamento de Biologia Celular e Genética, CB
Título: Inibição da função redox de ape1/ref-1 e sua influência no mecanismo de reparo de DNA e regulação transcricional em um modelo de estimulação inflamatória

RESUMO: A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1/REF-1) humana é uma enzima multifuncional que possui atividade de reparo de DNA e regulação transcricional, atuando como proteína reguladora de várias vias importantes para a homeostase e sobrevivência da célula. No entanto, o conhecimento sobre que mecanismos seriam dependentes de sua função de reparo de DNA ou regulação redox ainda é limitado, visto que a maior parte do conhecimento deriva de experimentos com silenciamento do gene de APEX1, nos quais ambas atividades d APE1 são afetadas. Este trabalho teve como objetivo caracterizar os efeitos da inibição da função redox de APE1/REF-1 em um modelo de inflamação. Inicialmente foi realizada uma revisão de literatura a respeito do envolvimento de enzimas de reparo de DNA em processos relacionado a resposta imune. Como modelo experimental células U937 foram estimuladas com 1 µg/ml de LPS e submetidas a dois diferentes tratamentos com 100 µM de E3330, um inibidor seletivo da função redox de APE1/REF-1. Foi realizada uma cinética de estimulação com um pré-tratamento de 1 hora com LPS e subsequente tratamento com E3330 por 2, 4, 6, 24 e 48 horas. No segundo modelo as células foram estimuladas com LPS por 24 horas e em seguida foi adicionado o E3330 por mais 4 horas. Após os tratamentos foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão de moduladores inflamatórios, avaliação da apoptose, produção de peróxido de hidrogênio e potencial de membrana. Foi realizado também uma análise de transcriptoma utilizando a plataforma 454 GS-FLX Titanium seguida de sua caracterização e categorização a partir de ferramentas de bioinformática. Para a validação da expressão diferencial e dos modelos propostos foi realizado experimentos de qPCR, western blotting, ensaio de degradação do rRNA, ensaio de incisão do sítio AP utilizando oligos marcados. E por fim foi utilizada a ferramenta iRegulon para localizar os sítios putativos de ligação à fatores de transcrição nos genes alvo identificados. Os nossos resultados mostram que após 24 horas de estimulação de células U937 com LPS e tratamento subsequente com E3330 durante mais quatro horas não afeta significativamente a viabilidade das células e a razão de apoptose. No entanto, no modelo de cinética inflamatória, foi possível observar uma redução das células viáveis como consequência do tratamento após 48 horas. Verificou-se também uma diminuição significativa de moduladores inflamatórios em presença de E3330. A partir do transcriptoma foram geradas duas listas com 619 genes regulados negativamente e 629 genes regulados positivamente, considerando fold change  ≤3 ou ≥3 respectivamente. Em relação a biologia de sistemas foi possível observar que as categorias funcionais mais enriquecidas na rede regulada negativamente estão relacionadas com expressão gênica, resposta imune, tradução, processamento de rRNA e biogênese ribossomal. Já na rede regulada positivamente foi observado um enriquecimento para transdução de sinal, resposta ao estresse, modificação da cromatina, resposta ao dano de DNA e regulação positiva da apoptose. Na quantificação de níveis proteicos foi possível observar uma diminuição estatisticamente significante após o tratamento com E3330 para c-MYC, NF-κB(p65), e um aumento da MDM2 de 60 kDa. Não houve diferença significativa entre os níveis de ERO e potencial de membrana mitocondrial. No ensaio de integridade de rRNA foi observado uma diminuição da razão 28S/18S nas amostras tratadas com E3330 em torno de 12% e 20% em relação ao controle e LPS respectivamente. Todos esses achados associados a inibição seletiva da função redox de APE1/REF-1, visto que no ensaio de incisão de sítio AP, a concentração de E3330 utilizada não foi capaz de inibir a função de reparo de DNA da proteína. De uma forma geral, para os genes da lista regulada negativamente, os FTs identificados com a ferramenta iRegulon são modulados por regulação redox, e a inibição com E3330 da APE1/REF-1 pode estar alterando a função dos mesmos e por isso diminuindo a expressão dos genes em questão. Já em relação a analise de regulação transicional dos principais clusters da rede regulada positivamente podemos perceber que poucos FTs são comuns entre eles e faz-se necessário um estudo mais aprofundado desses alvos. Nesta tese foi possível determinar eventos são regulados pela função redox de APE1/REF-1. Assim, nesse trabalho é proposto que o bloqueio seletivo da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 leva a uma redução da resposta inflamatória, bem como uma diminuição nos mecanismos que promovem a biogênese ribossomal e processamento do rRNA sem alterar a sua função de reparo do DNA.

 

Discente: Ana Rafaela de Souza Timoteo

Orientadora: Dra. Tirzah Braz Petta Lajus

Data: 12/12/2016
Hora: 14:00
Local: Anfiteatro das Aves – Centro de Biociências

Título: Identificação e caracterização molecular de mutações germinativas em indivíduos com síndrome de câncer de mama e ovário hereditário

RESUMO: A síndrome de câncer de mama e ovário hereditário corresponde a 10-15% de todos os casos diagnosticados de câncer de mama no mundo. A maioria das mutações germinativas são identificadas nos genes BRCA1 e BRCA2, contudo, a aplicação de painéis multigênicos tem aumentado o número de variantes patogênicas detectadas em outros genes supressores de tumor. De acordo com a versão atual do protocolo americano NCCN (National Comprehensive Cancer Network), as mutações em BRCA1 e BRCA2, TP53 e PTEN conferem alto risco de desenvolver câncer de mama, e mutações em CDH1, CHEK2, PALB2, ATM e BRIP podem aumentar em 20% o risco para o desenvolvimento desta doença. Neste estudo foram analisados 157 indivíduos com histórico pessoal e/ou familiar de câncer de mama. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico por meio de extração à base de solução salina e as amostras foram analisadas usando o sequenciamento de nova geração (NGS). Foram identificadas 15 variantes patogênicas e 4 VUS (Variants of Uncertain Significance) em 27 indivíduos (27/157; 17%), dos quais três são assintomáticos. Foram identificadas sete novas variantes em 4 genes: BRCA1_c.3409A>G; BRCA2_g.26826_30318del, BRCA2_c.5800C>T; BRCA2_c.5228G>A; BRCA2_c.5305delG; ATM_c.634delT e ATR_c.3043C>T. Sessenta e oito por cento (13/19; 68%) de variantes foi detectada nos genes BRCA1 e BRCA2, enquanto 32% (6/19) foram identificados nos genes de risco moderado ATM (2/19); ATR (1/19); CDH1 (1/19); MLH1 (1/19) e MSH6 (1/19). Os indivíduos foram separados em dois grupos para a análise comparativa: portadores de mutação nos genes de alto risco e nos genes de risco moderado. Entre os três indivíduos assintomáticos, duas variantes estão presentes nos genes de risco moderado ATM e MLH1. Entre os indivíduos com câncer de mama, dezoito pacientes (18/24; 75%) apresentaram mutações em genes de alto risco, enquanto seis (6/24; 25%) são portadores de mutações em genes de risco moderado. Ambos os grupos apresentaram alta incidência de câncer de mama precocemente (83% dos indivíduos). O grupo de portadores de mutação nos genes de alto risco apresentaram maior ocorrência de tumores de alto grau (83% vs 67%, P = 0,0090). No grupo de indivíduos com mutações em genes de risco moderado, os tumores apresentaram um fenótipo mais agressivo com câncer bilateral (33% versus 11%, P = 0,0002), ocorrência de metástases (33% vs 5.6%, P <0,0001) e óbito (33% vs 5.6%, P <0,0001). Ao todo, 1/3 de variantes foram identificadas em genes de risco moderado em pacientes com câncer mais agressivo. Estes resultados reforçam a importância da aplicação de análise multigênica em indivíduos em situação de risco para câncer de mama, especialmente em uma população heterogênea como brasileira.

 

        Entre os dias 29 de novembro e 02 de dezembro de 2016, foi realizado em Recife o XXI Encontro de Genética. Evento bianual que reúne pesquisadores e estudantes de Genética de toda região NE. O LBMG participou com as palestras  apresentadas pelas professoras Lucymara F. Agnez Lima, Silvia Regina B. de Medeiros e Viviane S Amaral, além de painéis e comunicações orais de estudantes. Parabéns a equipe da UFPE pela organização de um excelente encontro! O próximo encontro será em 2018, em Natal!

O LBMG conta com uma excelente estrutura para metodologias de biologia molecular e agora inclui, além de suas atividades de ensino e pesquisa, um projeto de extensão, voltado a prestação de serviços em sequenciamento nucleotídico, análise de expressão gênica por PCR em tempo real e aconselhamento genético. Metodologias essas com várias aplicações na pesquisa e no diagnóstico de doenças.

Os serviços estarão disponíveis para comunidade da UFRN, outras instituições de ensino e pesquisa do pais, além do setor privado. Além de se voltar para uma demanda interna da UFRN quanto às pesquisas, visto que os equipamentos e insumos são de alto custo, o que dificulta a aquisição e a manutenção dos equipamentos por parte dos pesquisadores, o projeto visa também atender uma grande demanda do Estado, uma vez que há carências nesse tipo de serviço, voltados a genética clínica.

Para mais informações, clique nos links abaixo ou fale conosco pelos contatos:

Sobre o Nugen

Guia de Sequenciamento

Sequenciamento de DNA pelo sistema PGM

Protocolos de Pesquisa

Kit de Metagenômica

            No dia 23 de setembro de 2016, o aluno do Programa de Pós-graduação em Bioquímica da UFRN, Daniel Chaves de Lima, defendeu sua tese de doutorado intitulada “Characterization of RadA/Sms from Chromobacterium violaceum and discovery of a new episome”. A banca era composta pelos professores Sávio Torres de Farias (UFPB), Leonam Gomes Coutinho (IFRN), Jorge Estefano Santana de Souza (UFRN), Raquel Cordeiro Teodoro (UFRN) e pela orientadora Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros (UFRN).

            Em sua tese, o aluno descreve a caracterização Bioquímica de um parálogo da proteína RecA, a RadA/Sms, em Chromobacterium violaceum. Além disso, a tese mostra os procedimentos que levaram a descoberta e caracterização de um novo plasmídeo encontrado nesta bactéria. O trabalho foi realizado em colaboração com o Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, na França, sob co-orientação do chefe de pesquisa Mauro Modesti, PhD, com bolsa do projeto CAPES-Cofecub.

            Daniel foi aluno do III Curso de Férias de Genética promovido pelo LBMG em 2005, com apoio financeiro da fundação Vitae, quando cursava o segundo ano do ensino médio no CEFET. Na época, foi selecionado para ser estagiário e bolsista de Iniciação Científica Junior no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG) mas por motivos pessoais não pôde participar do estágio. Em 2007, iniciou a sua graduação em Ciências Biológicas e já nos primeiros meses do curso vinculou-se ao LBMG como aluno de Iniciação Científica sob orientação da professora Dr. Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros que também orientou sua dissertação de mestrado, entre 2010 e 2012.

            Entre 2013 e 2014 Daniel teve a oportunidade de participar de um estágio de Doutorado-Sanduíche no Centro de Pesquisa em Câncer de Marselha (CRCM), na França. A bolsa de estudos, uma das milhares oferecidas pelo último governo da Presidenta Dilma, foi obtida por meio do edital CAPES-COFECUB, que visa um intercâmbio entre instituições do Brasil e França. Atualmente, Daniel é Professor do Instituto Federal do Rio Grande do Norte (IFRN), Campus Ipanguaçu.

    Foi publicado em junho de 2016 o segundo artigo do grupo ProteoChromo do Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG). O trabalho, intitulado “GeLC-MS-based proteomics of Chromobacterium violaceum: comparison of proteome changes elicited by hydrogen peroxide” teve seu aceite na revista Scientific Reports, do grupo Nature. Nesta pesquisa, o grupo descreve o maior proteoma da C. violaceum obtido até então, no qual mais de 1400 proteínas foram detectadas. Além disso, o grupo descreve o mecanismo de aclimatação desta bactéria cultivada em alta concentração de peróxido de hidrogênio, que induz estresse oxidativo.

Confira o abstract: Chromobacterium violaceum is a free-living bacillus with several genes that enables it survival under different harsh environments such as oxidative and temperature stresses. Here we performed a label-free quantitative proteomic study to unravel the molecular mechanisms that enable C. violaceum to survive oxidative stress. To achieve this, total proteins extracted from control and C. violaceum cultures exposed during two hours with 8 mM hydrogen peroxide were analyzed using GeLC-MS proteomics. Analysis revealed that under the stress condition, the bacterium expressed proteins that protected it from the damage caused by reactive oxygen condition and decreasing the abundance of proteins responsible for bacterial growth and catabolism. GeLC-MS proteomics analysis provided an overview of the metabolic pathways involved in the response of C. violaceum to oxidative stress ultimately aggregating knowledge of the response of this organism to environmental stress. This study identified approximately 1500 proteins, generating the largest proteomic coverage of C. violaceum so far. We also detected proteins with unknown function that we hypothesize to be part of new mechanisms related to oxidative stress defense. Finally, we identified the mechanism of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), which has not yet been reported for this organism.

O artigo completo pode ser encontrado no link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27321545.

O primeiro trabalho da equipe foi publicado em 2014 na revista BMC Microbiology e investigou os mecanismos de adaptação da C. violaceum cultivada em altas concentrações de ferro.

        Em reunião realizada em setembro de 2016 pelo colegiado geral do programa de doutorado Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) a UFRN foi eleita como nova sede do programa, tendo domo coordenadora geral a Dra. Lucymara F. Agnez Lima (LBMG-DBG-UFRN), cujo mandato inicia-se em janeiro de 2017.  A Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) foi criada em novembro de 2004 pelo Ministério da Ciência e Tecnologia com a finalidade de promover o avanço científico tecnológico, formar e capacitar recursos humanos na área. Trata-se de uma rede de pesquisa, cuja base é o programa de Doutorado em Biotecnologia (PPGB-RENORBIO, http://www.renorbio.org.br/portal/nucleo-de-posgraduacao.htm), nota 5 na CAPES, iniciado em setembro de 2006. Sendo um programa em Rede, sua sede é itinerante e eleita a cada dois anos. No momento, sua sede está na UFRPE e a partir de janeiro de 2017, passará para UFRN. Atualmente o programa conta com 248 professores e 791 alunos matriculados.